新冠病毒（SARS-CoV-2）的刺突S蛋白是介导其进入宿主细胞的蛋白，也是疫苗和药物研发的主要靶标之一。近日，科研人员发现，新冠S蛋白发生在D614G位置上的氨基酸残基突变可显著增强病毒的感染能力，并且降低了病毒对患者恢复期血清的敏感性。
当地时间6月20日，重庆医科大学感染性疾病分子生物学教育部重点实验室
黄爱龙团队在医学预印本平台bioRxiv上发表了题为：The D614G mutation of SARS-CoV-2 spike protein enhances viral infectivity and decreases neutralization sensitivity to individual convalescent sera 的最新研究论文，论文作者均来自重庆医科大学，通讯作者为全国政协委员、重庆医科大学校长黄爱龙、重庆医科大学教授唐霓等人。
此前，黄爱龙团队于4月29日、6月5日和6月18日短时间内在国际顶级期刊 《自然·医学》（Nature Medicine）发表了三篇论文，针对新冠病毒患者的抗体反应和无症状感染者的临床和免疫学特征展开研究。
此次研究中，黄爱龙团队详细阐述了新冠病毒S蛋白在614位置的显性突变（D614G突变）。研究表明，新冠病毒所属的RNA病毒突变率极高，这可能助长传播和毒性。
新冠病毒S蛋白中唯一的显著变异就是非同义D614G突变（天冬氨酸D变为甘氨酸G）。原始数据表明，S-G614是SARS-CoV-2的致病性更高的毒株，具有较高的传播效率。此前也有研究称，SARS-CoV-2变体的S-G614蛋白中存在一种新的丝氨酸蛋白酶（弹性蛋白酶-2）切割位点，但是目前科研人员尚不清楚S蛋白中D614G的转化如何影响病毒的感染性，也不清楚S-G614蛋白是否可以在细胞模型中被弹性蛋白酶-2处理和激活。
在此研究中，科研人员发现，D614G突变在所有分析的序列中占比高达64.6%，在全球范围内存在大量自然分布。
研究人员通过慢病毒表达系统等还发现，这一突变可以增强蛋白酶对S蛋白的切割能力，从而促使病毒具有更强的感染能力。
此外，D614G突变改变了S蛋白甚至是整个病毒的免疫原性，进而降低了康复期血清对病毒的敏感性。
作者们认为，这项研究将有助于理解SARS-CoV-2的传播，同时推动新冠疫苗的设计和药物研发。
D614G突变增强S蛋白切割能力，使病毒有更强感染能力
研究人员首先通过数据库比对发现，S蛋白D614G突变体存在自然分布，且在全球范围内新冠S蛋白中观察到的前10个最丰富的非同义突变中，D614G突变表达的相对丰度最高，这个突变在所有分析的序列中占比高达64.6%。
因此，研究人员认为，D614G突变在新冠病毒进化过程中可能具有选择优势。而此前的研究显示，携带D614G突变的新冠病毒毒株已经取代2019年的原始毒株成为了主流新冠病毒株。根据近日公布的数据，导致6月北京新发地新冠疫情的病毒也均带有D614G突变。
D614G突变为何使新冠病毒有更强感染力、更易进入宿主？
通常来讲，冠状病毒利用两种不同的途径侵入细胞：一种是蛋白酶介导的细胞表面途径（protease-mediated cell-surface），另一种是胞内体途径（endosomal pathway）。
冠状病毒S蛋白会被宿主细胞的蛋白酶切割成S1亚基和S2亚基，其中，S1亚基负责受体识别和结合，S2亚基负责感染过程中入侵阶段的膜融合。
而通过蛋白酶切割实验，研究人员发现D614G这种突变引入了另外一个弹性蛋白酶2切割位点，进而可以增强蛋白酶对S蛋白的切割能力，促进了其裂解和病毒细胞的进入。这预示着S-D614G突变体对宿主细胞，甚至是个体有更强的感染能力。
研究人员发现，转染pS-G614的细胞显示出比转染pS-D614的细胞更强的S1信号，这表明D614G突变改变了细胞蛋白酶对S蛋白的裂解性。
随后，科研人员又通过慢病毒表达系统成功构建新冠病毒突变体假病毒（含有荧光素酶报告基因），使用表达人类新冠病毒受体ACE2（293T-ACE2）的HEK293T细胞测试ACE2表达与假病毒易感性之间的关系。
研究人员发现，并且证明新冠病毒突变体假病毒在HEK293T细胞上的感染能力，不管从包装效率还是感染、表达能力等方面都更加强劲。
在实验中，使用携带G614的新冠病毒S蛋白变体，在细胞模型感染后48小时，病毒转导量比携带D614的新冠病毒S蛋白变体增加了2.2倍；此外在细胞感染S-G614假病毒后72小时，研究人员观察到最高的病毒转导效率比S-D614假病毒高约2.4倍。
S-G614蛋白假型病毒显示出感染力有所增加
这意味着，当标准化输入病毒剂量时，S-G614假病毒的进入效率是S-D614假病毒的2.4倍左右，这表明D614G突变可促进SARS-CoV-2的感染性并增强病毒的传播能力。
研究人员还指出，由于假病毒是单轮感染检测，因此体外实验中病毒进入效率的这种看似很小的增加可能会导致体内病毒感染性的巨大差异。
突变可使康复患者血清中和效应大幅降低
恢复期血浆疗法是一种传统的输血治疗方法，在严重急性呼吸综合征（SARS）、埃博拉出血热、中东呼吸综合征等新发突发传染病疫情的救治中均发挥了一定作用。在此次新冠疫情期间，也有研究证明从新冠康复病人血液中提取的免疫球蛋白有更高的中和能力、更高的特异性。
对此，黄爱龙团队通过体外微量中和实验，对康复者血清对突变体病毒和未突变病毒的中和能力进行了验证。
2020年2月5日至2月10日期间，研究人员从重庆市的三家定点医院收集了总共41例恢复期新冠患者血清样本（症状发作后2-4周），并探索它们对突变体假病毒的抑制作用。
研究者们发现，93％（38/41）的恢复期新冠患者血清样本可以中和S-D614和S-G614两种假病毒，并且具有相当的效率。但是值得注意的是，大约7％（3/41）的恢复期血清样本显示出对S-G614假病毒的中和活性降低。
在所有样本中，来自1号、7号、40号病人的血清对突变体假病毒的抑制作用是降低的，而对野生型病毒的中和能力则非常强（甚至存在3-4倍的中和差异）。
其中，1号病人的血清对突变体假病毒完全失去了中和能力，而此前的实验证明，它可以中和大约30%的原始病毒。
此外，上述3例患者血清样本在ID50（半数抑制剂量，在50%的实验动物造成感染的微生物剂量）的S-D614假病毒中显示出894至1337的较高的中和活性，但在S-G614假病毒中，其ID50的中和活性仅为216至367，明显有所降低。
研究人员表明，这意味着在携带D614G突变的新冠病毒中，康复患者血清样本对于病毒的中和效价仅为原来的（针对未突变病毒）约四分之一。
研究人员据此得出结论：新冠病毒S蛋白的D614G突变改变了S蛋白甚至是整个病毒的免疫原性，进而降低了康复期血清对病毒的敏感性。
研究人员最后提到，本研究设计中也存在一些限制性条件。比如实验使用的是新冠病毒突变体假病毒，缺失S蛋白C末端第19位氨基酸；本次中和实验主要围绕S蛋白展开研究，相关的其他蛋白或者表位没有考虑在内等。
作者们指出，需要进一步使用真正的SARS-CoV-2病毒进行其他测定实验，同时也应针对D614G以外的其他病毒突变展开研究评估。
